纳米抗体在诊断和治疗方面应用的优势

发布时间:2019-07-09 13:12 作者:香港金财神玄机

  纳米抗体(Nanobodies, Nbs)作为抗体行业的新成员,是传统抗体(Antibodies, Abs)的有益补充,在诊断和治疗等不同的生物技术领域具有巨大的应用潜力。目前已报道有很多生产纳米抗体的方法,但是这些方法在抗体产量、亲和性和降低生产成本方面依然具有很大的改进空间。本文综述了这些挑战,以及利用纳米抗体检测蛋白质和小分子等不同类型分子的最新进展,并阐述了它们在体内无创成像和体外检测中的潜在应用。此外,还概述了Nbs的独特性质,如内化、尺寸、热稳定性和化学稳定性、亲和力、血液清除率和标记处理。在纳米抗体治疗应用方面,列举了一些已经报道的关于Nbs用于治疗癌症、神经退行性疾病或传染病等疾病的例子。最后,论述了纳米抗体在未来的发展趋势、机遇和不足。

  抗体(Abs)被认为是检测和靶向最好的生物分子之一。抗体具有高亲和性和高特异性的优点,可用于研究、诊断和治疗。然而,对目前正在使用的Abs的某些性能的改进需求也越来越高。

  多种免疫分析方法已被开发以解决与诊断问题(包括是否存在特定抗原(Ag)、分析样本中存在的特定物质的数量或在不同组织中定位一种化合物)相关的不同问题。此外,最近诊断应用集中于开发一种生物传感器,这个生物传感器能够快速检测特定分析物,并应用于医生的办公室(称为护理点(PoC)设备)和非侵入性的体内成像领域。抗体也被用于治疗领域,阻断靶标与相应受体的相互作用,或破坏它们识别后引起的一系列信号转导。

  抗体或免疫球蛋白(IgGs)是一种血清糖蛋白,在外源刺激物(Ag)作为防御机制存在后参与免疫反应。IgG由四个多肽链组成,形成特征性的Y型结构(图1)。从这个一般结构中可以识别出多个片段,如抗原结合片段(Fab)和包含生物识别区域、但缺少恒定片段的单链可变片段(scFv)。

  由于单域抗体(通常被称为纳米抗体(Nbs))具有一些良好特性,在一些领域已经被作为传统抗体的替代品。Nbs主要来自于骆驼类,如美洲驼、羊驼或骆驼。这些宿主动物有能力生产只含有重链(HCAb)而完全缺乏轻链的免疫球蛋白。重链被构造成两个恒定区域(CH2和CH3)、一个长铰链区域和Ag结合域VHH。具体地说,VHH是由不同的区域组成的,其中一些区域(FR)比较保守,其他区域负责特异性的识别Ag,称为互补决定区域(CDRs) ,CDR3是识别程度最好的识别位点。因此,Nbs是通过重组技术产生的提高VHH区域的抗体片段(图1)。

  纳米抗体是纳米级别大小的物质,能够提高传统的单克隆抗体理化性能,同时保持其特异的识别位点。本文详述了纳米抗体的主要优势,以及如何调整它们的特征以适用于特定功能 (图2)。

  从这个意义上讲,用重组技术获得Nbs的一个主要优点是几个标签可以融合到它们的三级结构中,如His标签,甚至是绿色荧光蛋白(GFP)等荧光标签[8]。此外,纳米抗体还可以大规模生产,产量很高。其结构中缺少轻链,使其具有低免疫原性,在耐热性、展开可逆性、蛋白水解性和高溶解性方面具有更好的稳定性[9,10]。纳米抗体比传统的IgG(150kDa)或其相应的Fab片段(55kDa)或scFV(28kDa)更小(15kDa),后者可以通过化学方法或重组方法制备。这些片段的稳定性较低可能是与相应的IgG相比亲和力较低的原因。这一稳定性低的特点可以被Nbs克服,因为它们具有更高的稳定性和保持纳摩尔范围内亲和参数的能力[11]。

  虽然,Nbs目前的应用领域主要与诊断和治疗目的有关[3,12,13],但也被用于生物化学机制的研究以及结构生物学研究。关于诊断,据报道Nbs是一种有效的体内(诊断试剂盒)和体外应用工具(例如用于成像,主要通过添加不同的标签来帮助监测)。另一方面,靶向抗原特异性在治疗应用上是一种非常实用的治疗优势;例如,Nbs是治疗如癌症这类疾病的潜在候选药物,并显示出跨越血脑屏障的潜力[6]。

  纳米抗体产品:纳米抗体生产的主要挑战之一是选择和确定制备的最佳工艺。获得包含所需遗传信息的文库对于生成具有高特异性和亲和性的Nbs至关重要。抗原特异化的Nbs可以通过免疫库、天然库或合成库产生[7]。

  免疫文库是产生Nbs最常见的选择。它们需要对骆驼科动物(如骆驼、单峰骆驼、美洲驼或羊驼)进行主动免疫。通过抗原诱导免疫产生体外Nbs需要在免疫后从分离的淋巴细胞中提取mRNA[14]。一旦特定序列被扩增并插入到克隆载体中,利用噬菌体显示技术或使用诸如细胞表面显示、mRNA/cDNA显示或MS光谱鉴定等其他方法进行筛选以分离最合适的Nbs[7]。进行这种筛选最常用的策略是基于噬菌体显示选择。主要包括从淋巴细胞中分离mRNA,然后通过PCR扩增成熟Nb序列的编码序列,再加入限制性内切酶位点,将不同的片段插入噬菌体克隆载体中。随后,VHH文库通过感染噬菌体表达系统而产生。最后,需要进行抗原特异性噬菌体选择。选择最合适的克隆后,得到相应的可溶性VHH(图3)。选择最合适的噬菌体展示Nbs是至关重要的。这一步通常使用体外测试(即噬菌体ELISA),结合你要测定的Ag。鉴定阳性噬菌体通常需要两到三轮筛选。但是,如果Nb选择的特异性标准较高,则获得定制Nb所需的轮数可能会增加。在选择之后,相应的Nbs将通过表达系统在体外进行生产。目前这类文库的主要优点在于预期的特异性是由Ag的抗原性决定的。此外,与传统的多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体显示技术制备Nbs的速度较快,成本较低。

  从原始库中选择Nb是通过利用宿主动物本身的自然免疫多样性,而无需免疫[2,12]。因而,需要大量的血液来增加遗传多样性。显然,当寻找识别低免疫原性靶点的特定Nbs时,这种策略是最合适的。此外,这是一种比前一种更为普遍的定向方法,允许从抗原较少的化合物中产生Nbs。在任何情况下,这一过程的成功都取决于采集的血样数量,应考虑到只能获得高特异性的Nbs。其他依赖于半合成/合成库的策略主要基于保持Nbs的共同保守结构和随机改变相应的CDR序列。准备这些类型的库所能引起的多样性程度比依赖于原始库的方法要高。这是因为它们能够在选定的CDR区域引入不同的氨基酸。因此,这些种类的文库被认为是一种可以替换包括动物免疫在内的传统方法的新方法。

  关于Nb的获得,可以使用多种不同的表达模式,包括细菌、酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞,甚至植物宿主[15]。应用最广泛的表达系统是大肠杆菌,它在不同的细胞空间中表达蛋白质。使用这种表达宿主的主要优点是它能够产生可溶性的功能性Nbs,并且生产成本低廉。但是,其与酵母菌或真菌等生物表达系统相比,产量不是很高。另一种常见的用于产生Nbs的方法是利用哺乳动物细胞。这是为治疗目的生产Nbs时最合适的选择,尽管它们的成本、较长的时间要求和复杂的处理过程,使得它不能成为首选方案。其他可能的方法包括使用酵母和真菌,这已经成功地被应用,但生产过程仍然复杂。

  此外,与传统单克隆抗体相比,Nbs可以在不同的生物体中表达,这是一个优势,因为它允许插入定制的标签,以低成本和大规模生产。

  纳米抗体的独特特性与传统抗体相比具有一些显著的优势,这是值得我们注意的。因为它们结合了单克隆抗体的理想特性和小分子药物的一些有益特性。

  ❆它们能结合多种表位,显示在毫微摩尔甚至皮摩尔范围内的亲缘关系。这意味着Nbs的亲和力与传统单克隆抗体相当或优于传统单克隆抗体,达到皮摩尔亲和力常数范围[16,17]。他们已经进化到显示出高度的特异性和亲和力,仅仅呈现出3个CDR而不是6个出现在传统的抗体中[17]。晶体学研究已经报道了[18],Nbs抗原结合环显示一个更大的结构库。此外,CDR3区域通常比单克隆抗体的VH区域长。

  ❆程序化或多值化的可能性。考虑到Nbs的小尺寸及其单体性质,可以对其进行基因工程改造,以获得可融合的模块化,从而形成一个新的结构,实现多特异性和多功能性。出于治疗目的,双价和双特异性Nbs是一种非常有吸引力的形式。双价性使得Abs能够以极大的亲和力与多组分的Ags结合,而双价性包括同时与两种不同类型的Ag结合[20,21]。这些类型的免疫抗体可以通过分子工程来生产,在大多数情况下可以得到嵌合抗体。这种选择对于治疗应用和延长这些免疫试剂的半衰期特别有吸引力。他们是高度稳定和可溶性的。

  ❆Nbs具有最佳的生物物理和生化特性。Nbs具有最佳的生物物理和生化特性,包括溶解度、耐热性和蛋白水解抗性。CDR3环的折叠和骨架-2区域的亲水性使其在水溶液中溶解度高,且不易聚集[22]。此外,它们具有很高的构象和热稳定性。因此,Nbs在37°C条件下1周后仍保持充分的结合能力[23],热展开行为常被阐述为在90°C条件下长时间孵育后完全可逆[24]。除了耐热性,Nbs在蛋白酶、促溶剂和极端pH的条件下是稳定的[25]。此外,他们可以定制,以绕过细胞内蛋白水解。这种行为,连同它们调节目标活性的能力,使它们成为破坏细胞内Ag活性的完美药剂,产生功能性敲除。为了实现这一目标,已经开发出了内含子,它是重组的Ab片段或Nbs,已在细胞内表达为目标细胞内蛋白。它们对于对抗细胞内病原体或治疗神经退行性疾病非常有用[26]。蛋白水解抗性及其在极端条件下的稳定性也使其适用于其它给药途径(如,口服)。关于将Nbs用于诊断目的,Nbs在高有机溶剂浓度或pH或温度极值下的高稳定性为检测小分子或蛋白质开辟了广泛的应用[27]。这是由于这些物理特性允许使用更有效的固定化方法用于生物传感目的、在预浓缩步骤后在低浓度下分析污染物的可能性,甚至允许一个增加生物识别的动力学在高温下工作。

  ❆深层快速的组织渗透,快速的血液清除。由于组织内的被动细胞间扩散速率依赖于分子大小,且与分子大小呈近似反比,因此与传统单克隆抗体(150 kDa)相比,15 kDa单价Nb的穿透性更好。考虑到Nbs可被设计用来修饰或中和致癌分子,将其重定向到特定的细胞间室,或在肿瘤细胞表面表达它们以触发免疫应答[28],这一特性对靶向肿瘤非常有用。由于治疗通常需要高剂量和频繁使用特定的治疗药物,目前已经开发了几种方法来延长HCAbs的半衰期。包括添加聚乙二醇[29],结合白蛋白,或融合到传统Ab的Fc片段。然而,值得指出的是,在某些特定应用中,这种具有Nbs特征的药物能够被肾脏快速清除,极大的避免了毒性作用。此外,由于Nbs体积小,人们对其跨越血脑屏障的能力寄予厚望[3,6]。

  ❆识别隐藏的表位。传统Abs的结晶学研究表明,在大多数情况下,抗原结合面是平的或凹的[30]。相反,Nbs常与裂隙和空腔结合(见[31])。缺少可变轻链(VL)与显示扩展的CDR1和更暴露的CDR3的VHH区域相平衡。这些结构的变化允许标准的绑定架构,如平面和空腔,但也包括绑定突出的环路或缝隙的可能性[32]。因此,Nbs的这一特性及其较小的尺寸促进了与传统VH-VL对所不能达到的新表位的相互作用,这也解释了Nb结合和中和传统抗体难以命中的靶点的能力。

  ❆免疫原性。骆驼的VHH结构域与人类VH结构域具有高度的同源性,这意味着到目前为止,它们还没有表现出任何意想不到的免疫原性反应,这可能是临床应用的一个潜在问题[2],这可能会成为临床应用的一个潜在问题。然而,仅在长期治疗的情况下,首先将框架2区域人性化是一个安全的选择,以获得与人类VHs相比具有高度同源性的氨基酸序列。考虑到该基因仅包含约380对碱基对,通过直接定点突变就可以实现Nbs的人源化[33]。

  ❆生产成本。单克隆抗体是一种大的多聚体蛋白,通常经过翻译后修饰。因此,它们的生产需要复杂的仪器,只有在真核生物系统中才能实现。此外,为了达到临床疗效的治疗,这些分子必须给予大剂量。所有这些要求的结果导致需要使用非常大的哺乳动物细胞培养和漫长的筛选和纯化步骤,造成非常昂贵的生产成本,并限制了它们作为治疗药物的生产。Nbs是解决单抗生产成本问题的一个很好的选择。由于完全恢复了免疫特异性,Nbs可以在微生物系统(如细菌、酵母菌、真菌)中很容易表达,并且可以从展示文库中快速选择。此外,通过使用测序技术,它们对于高通量筛选特别容易管理。所有这些生产和选择的优势导致更低的制造价格。

  大多数商业诊断测试是基于某些特定疾病相关的蛋白质的检测,大部分依靠抗体的使用。然而,在某些情况下Ab可能会失去稳定性和生物识别特性。考虑到Nbs一旦固定在固体支架中,其在长时间内具有抗性和稳定性,Nbs可以作为一种很好的替代品[34]。

  近年来,基于Nbs的侧流法测定血浆中丛锥虫的感染[35]。检测是通过确定一个经过生物湮没后的特定的生物标志物。免疫接种是用锥虫分泌体的混合物进行的。该选择是通过观察分泌体化合物纳米抗体的MS鉴定做出的。分泌体化合物纳米抗体是由所产生的Nbs结合而成的,在诊断和治疗应用方面具有突出的特点,并可寻找55至70 kDa之间的单个蛋白带的出现。该条带与孔雀鱼的丙酮酸激酶相对应。随后,研制了ELISA试剂盒,并在血浆中进行了成功的检测。最后,建立了基于Nbs的侧流法测定寄生虫血症,灵敏度(79.2±16.2),特异性(91.9±8.8)。采用LFA法和ELISA法测定血浆LOD分别为220 ng/mL和14 ng/mL。

  据报道,抗独特型Nbs的生产可用于测定对转基因生物分析有重要意义的Cry1Ab毒素[36]。在这种情况下开发的化验是一种在作物中测试的化学发光免疫性化验。在这种情况下,选择是通过一个高质量亲本文库噬菌体展示。利用抗cry1ab单克隆抗体作为模拟抗原,通过对所述抗体的对位识别,进行生物克隆。当直接应用于谷物样品时,其工作范围为10.49-307.1 ng/mL。

  关于细菌的检测,在文献中可以找到一些关于主动免疫蛋白或相关的生物标志物产生Nb的例子。然而,使用亲本库的例子很少。屠呦呦和他的同事报道了其中一种细菌,该细菌产生了用于检测牛奶中单核增生李斯特菌的Nbs,并开发了一种LOD值为104 cfu/mL的夹层免疫分析法[37]。Nbs还可用于监测生物分子,如酶。例如,Zafra和他的同事报告了用从好氧和厌氧微生物中分离的12种纯化酶的混合物进行免疫,这些酶与主要的解毒作用有关[38]。因此,作者利用噬菌体展示方法进行了有效的筛选,同时对免疫抗原混合物的每个单独成分进行了筛选。用这个方法,可产生针对12种目标酶的特异性Nbs。

  Nbs已成功应用于生物传感器的开发。生物传感器是生物受体(在本文中为Nb)与传感器紧密接触的装置,传感器将生物识别过程转换为可测量的信号。在此基础上,Campuzano和他的同事开发了一种基于磁性颗粒的竞争性免疫传感器,并使用电化学读数来测定纤维蛋白原[39]。研究了间接和直接两种方式,分别将Nb或竞争对手固定在磁珠上。两种检测结果显示出相似的检测能力,间接的更好,LOD值达到了0.044μg /毫升。

  生产用于检测低分子量化合物( 1000da)的抗体需要制备模拟目标分析物理化性质的免疫半抗原[40]。半抗原的制备已成功地用于多种化合物的制备,包括与环境、食物基质和生物样品有关的目标化合物。随后,利用这些半抗原制备了多克隆抗体和单克隆抗体。然而,尽管这些Abs具有优异的分析性能,但使用这些Abs表明,有必要提高其对温度或有机溶剂等重要外源试剂的稳定性,而Nbs对这些外源试剂具有很高的耐受性[41,42]。

  第一次尝试生产小分子Nbs时,能够在微摩尔范围内检测到甲氨蝶呤[43]和偶氮酮[44]。当对四溴双酚A[45]进行基于nbb的免疫分析时,检测限被提高到低纳摩尔范围,这使得检测所需的水平成为环境暴露风险评估的一部分。在食品安全方面,Nbs已被用于真菌毒素的测定,并成功地应用于农作物中这些化合物的检测[27]。正是在这些领域,Nbs对温度和有机溶剂的耐受性的优势非常重要,因为它们可以用于不同环境中污染物的检测。因此,Wang et al.[45]和Kim et al.[46]报道了耐有机溶剂浓度高达50%甲醇和DMSO的Nbs的开发方法。Pan及其同事[47]不仅对上述溶剂具有Nb耐受性,而且对丙酮和乙醇也具有Nb耐受性。在所有情况下,Nb的分析参数与在缓冲条件下得到的分析参数相似。关于耐温性,Liu和同事[48]通过与样品一起预孵育来测试Nbs的稳定性。所有检测的Nbs在50℃条件下,5 min后性能保持完好,有的甚至在100℃条件下,5 min后仍可使用。此外,他们还表明,在90°C的温度下,Nbs在75分钟后能够达到60%的活性。关于Nbs在不同酸碱度下的稳健性,也发现了类似的现象。Wang博士和他的同事[45]报道了pH 7.4到10之间的稳定性。

  检测低分子量分子通常需要建立直接或间接的竞争性检测方法。因此,需要Ab标记来可视化与相应的目标分析物的结合。考虑到Nbs可以重组表达,在克隆过程中可以加入报告基因标签(如GFP或碱性磷酸酶)作为标记物,保持初始Nb的分析性能不变[49]。最近报道的另一种策略包括使用独特类型的Abs作为替代标记,同时检测目标污染物,并在每十亿分之一的范围内提供LODs[50]。在本文中,这些抗特异性Nbs被固定在免疫层析条带中,目的是建立一种时间分辨荧光免疫层析法测定zearalenone和黄曲霉毒素B1 (APB1)。尽管Nbs具有许多优点,但它们在测定小分子方面还没有得到广泛的应用。因此,关于这类靶标的免疫传感器的发展,文献中仅能找到几个例子。在这方面,Pan和他的同事报道了另一个值得注意的有价值的例子,他们开发了一种电化学免疫传感器来直接测定黄曲霉毒素B1,Nbs固定在修饰过的玻碳电极上,LOD为3.3 pg/mL,可以测量真实样品。该系统可直接测定APB1,无需任何标记。

  因此,考虑到其优异的性能,特异性Nbs对小分子的潜在诊断应用仍有待开发。它们体积小、适合生物工程、溶解度高、化学稳定性好,克服了基体干扰,提高了常规Abs的分析能力。

  目前,早期诊断不仅涉及到特异性生物标志物的体外检测,还有其他非常有用的应用。这些包括体内诊断程序,如分子成像技术,临床医生广泛使用用于可视化可能的疾病异常,主要是肿瘤。在此背景下,基于核成像的不同方法正在开发中,如单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)[12]。体外成像技术对于评价器官和组织的生物分布也很有意义。在这些病例中,免疫荧光是评估和定位感兴趣的生物标志物的主要工具之一。

  如果需要在VHH中加入放射性同位素或荧光团,通常使用重组技术。但也有其他的可能性,主要包括化学修饰。值得一提的是,在此背景下Nbs可以设计为变色体。这种Nbs依赖于Nbs等功能结合分子与荧光蛋白偶联的能力。这为Nbs增加了更多的价值,因为可以依靠它们的大小,用于细胞骨架网络或核组件的可视化[51,52]。它们已被证明是作为高分辨率成像探针使用的有用工具。当Nbs功能化需要化学修饰时,应利用正交官能团来控制标记化合物的共轭位置。这些标记分子包括荧光团、酶示踪剂、生物素或不同的药物[53]。因此,考虑到Nbs可以作为很好的示踪剂,它们可以被认为是一个很好的选择,用于靶向肿瘤或其他类型的疾病,如类风湿关节炎。表皮生长因子受体(EGFR)是目前研究的热点之一,它与不同的上皮细胞肿瘤如皮肤、肺、头部和颈部肿瘤直接相关[54]。因此,EGFR是用于肿瘤定位的最佳生物标志物之一,它也可以用于成像应用的放射标记,甚至可以与治疗不同类型癌症的药物结合使用。为了实现这一目标,最常用的方法之一是用放射性同位素99mtechnetium (99mTc)对其进行标记,99mTc广泛用于癌症成像。利用[99mTc(CO)3(H2O)3]+盐对制备的EGFR Nb进行放射性标记,该盐与His-tag具有亲和关系。所得到的生物偶联物用于小鼠的体外测量,以评估其生物分布,并用于SPECT成像,识别EGFR过表达。Nbs与近红外(NIR)染料结合也被用于基于HER2肿瘤生物标志物的癌症成像。Debie和他的同事研究了控制标签结合方法的相关性,以获得最佳结果和改善药物动力学[55]。一方面,nhs激活的NIR标签通过可自由接近的赖氨酸与Nb随机耦合。另一方面,近红外标签是专门耦合到羧基端不成对的半胱氨酸形成二硫键。羧基标记的Nbs的亲和度是通过测量解离常数KD来确定的,KD约为4.5 nM;而随机标记则受共轭过程的影响(KD值在20 ~ 60nm之间)。然而,在体内和体外实验后获得的结果有助于使用标记的Nbs更精确地识别HER2过表达。位点特异性和随机标记的Nbs显示肿瘤快速积累,非特异性摄取低,导致早期肿瘤与肌肉的比值高(注射后3小时HER2阳性肿瘤分别为3.4±1.6和3.5±0.9 (p.i.),而HER2阴性肿瘤1.0在3h后 p 0.05)[55]。因此,影像学诊断已被证明是Nb最强大和使用的应用之一,利用其固有的小尺寸和随后的快速肾脏间隙。使用放射标记或荧光探针可以很容易地功能化Nbs,使其成为体外和体内成像的理想选择。这些综合特性也使Nbs成为疾病诊断的理想工具。

  1975年,Kohler和Milstein在治疗领域取得了突破性进展,他们开发的小鼠杂交瘤技术可以高效生产单克隆抗体(mAbs)[56]。目前,不同的单克隆抗体已被批准作为治疗广泛的适应症,如肿瘤[57],传染病[58],移植排斥[59]等。尽管取得了显著的成功,这些分子在用作治疗化合物时面临着重要的问题。首先,它们的大尺寸限制了有效的组织穿透,以及通过血脑屏障的通道。考虑到它们的小鼠来源,它们可能会产生一些免疫原性效应,而这些效应只有通过培养人源化的抗体才能克服。此外,它们的生产需要很长时间,而且由于涉及使用细胞培养技术和繁琐的筛选程序,成本也有所提高。在此背景下,分子生物学和噬菌体显示技术的发展提高了获得工程和定制抗体或抗体片段的可能性,这些片段可以克服上述单克隆抗体的一些限制。新策略的目标是生产更小尺寸的支架,易于选择和生产。因此,鉴于其生物物理和生化特性,Nbs似乎特别适合于药物开发。利用Nbs治疗疾病和病理主要依赖于抑制靶受体的相互作用。在此基础上,利用Nbs的多目标化能力,在处理复杂疾病时,可以同时针对不同的途径和/或不同的因素。自从Nb技术被发现以来,它的应用范围迅速扩大,最近发表的关于这一课题的科学论文数量的增加就证明了这一点。因此,Nb的临床应用已被探索和报道在不同的医学领域,如肿瘤学,传染病和神经系统疾病,炎症病理学等。这里回顾了一些例子,以强调Nbs作为未来理想的治疗工具,作为一种独特的治疗手段或与其他治疗策略相结合。目前有几家公司生产Nbs或Nbs衍生产品,它们都处于不同的临床发展阶段,但没有一个上市或四期临床[6]。抗体在对抗病毒、细菌和寄生虫感染方面发挥着重要的天然防御作用。为了对抗病毒,Nbs可以在病毒复制周期的不同阶段发挥作用,包括病毒细胞附着、病毒进入和病毒脱壳。一个很好的例子是一种以H5N1型血凝素为靶点的二价Nb,从而防止甲型流感病毒附着于宿主并避免随后的病毒复制[60]。这是一种中和Nb的鼻腔给药小鼠。对于细菌来讲,Nbs是一个非常有吸引力的选择,因为抗生素耐药性的出现、目前可用治疗的费用高和缺乏新的抗生素开发。Nbs可以对抗细菌表面蛋白升高,可以结合细菌的运动机制,可以抑制VI型分泌系统,防止毒素分泌等策略。一种非常有趣的方法是基于中和病原体分泌的毒性因子,因为它不涉及针对细菌本身。这种方法可以克服抗生素耐药性,因为它不是基于杀死细菌。因此,针对难辨梭状芽胞杆菌(梭状芽胞杆菌是一种多重耐药细菌,可导致住院患者的抗生素相关腹泻),人们开发了不同的Nbs来阻断双CDT毒素(难辨梭状芽胞杆菌转移酶)。在此背景下,已经有文献报道了针对CDTa和CDTb的两种Nbs的产生,这两种Nbs能够在等摩尔浓度下有效阻断双毒诱导的细胞毒性[61]。

  Nb技术的另一个重要应用是神经退行性疾病的治疗。这类疾病主要是由细胞内蛋白质的异常展开或聚集引起的(例如,帕金森氏症,阿尔茨海默氏症和亨廷顿氏症)。因此,考虑到内含子能够穿过血脑屏障,一旦进入细胞,就可以改变蛋白质折叠和/或相互作用,因此内含子可以被认为是一种很好的治疗选择。在这种背景下,抑制β-amyloid的形成原纤维通过使用特定的Nbs报道作为一个合适的策略用于治疗阿尔茨海默氏症。例如,Lafaye等人,获得了Nb对β淀粉样蛋白(Aβ)肽(V31-1)阻止Aβ-induced神经毒性,避免了原纤维形成[62]。Nb能够区分不同构象的肽(低聚物、原纤丝和纤维),认识到只有低聚物和能够防止淀粉样原纤维的形成稳定原纤丝和中和的可溶性分数低聚物的Aβ孤立在人类的大脑。

  最后,Nbs治疗癌症的显著优势在于其特异性、良好的组织穿透性和快速清除。这些特点允许肿瘤穿透,同时避免健康细胞的损害。它们可以作为拮抗药物使用,但没有Fc-effector域会降低它们的疗效,但同时将副作用降到最低。在这方面,有希望的方法包括使用靶向部分结合效应域,甚至用含有致癌药物的纳米粒子修饰Nbs。另一个重要的挑战是脑癌治疗方法的发展。在这种情况下,Nbs对BBB的穿膜能力可能非常有用。当在肿瘤细胞中表达时,内含子是另一种合适的重定向抗肿瘤触发剂的选择。

  此外,这些内含物中和或修饰了存在于特定亚细胞区里的致癌分子的活性。其他已经报道的临床应用包括使用Nbs来对抗静脉、炎症过程、解毒、细胞因子和血液凝固级联。

  因此,在高通量时代,对特定Nbs的筛选将逐步成为一个快速、廉价的标准化过程。这将扩大Nb在临床诊断、治疗和环境污染监测中的应用。此外,其优异的性能,以及针对不同分子或不同途径的可能性,或与其他治疗方法结合使用,使它们成为治疗领域的理想工具。值得注意的是,即使Nb有如此优异的性能,市场上仍然没有基于Nb的产品。这一事实可能是由于非常严格的知识产权政策、长期、复杂和昂贵的临床试验,以及缺乏使新技术对新治疗策略至关重要的因素造成的。

  由于分子生物学领域的重大进展和许多高通量技术的出现,以及它们自身的理化性质和合理的价格,Nbs是一种实用的诊断和治疗手段。

  抗原引导的主动免疫是目前最推荐的产生高亲和力Nbs的策略。然而,在避免动物处理和利用半合成/合成库提高Nbs亲和力方面,已经取得了很大的进展。但要保证Nbs的高亲和选择性,还需要更合理、更快的平移方法。

  Nbs在高浓度有机溶剂和极端的pH值和温度下的稳定性,在小分子的检测方面应用广泛,例如为生物传感器的开发提供更有效的固定化方法,分析预浓缩步骤后低浓度污染物(通常是使用有机溶剂洗脱),或通过高温生物识别的动力学。

  整合Nbs成不同的纳米技术系统,如纳米载体或生物传感器将改善目前Nbs中发现的一些弊端,如肾清除率的下降或完成传感器的高效重折叠和功能化,获得更好的亲和力的感应。此外,还可以封装Nbs以提高其溶解度,包括药物或用于治疗诊断的放射性标签。

  他们的“即用”潜力使他们成为医疗保健市场中最佳的成像或治疗剂,目前正在进行不同的临床试验。

  聚焦在治疗领域,Nbs可以克服第一代抗体具有的一些限制,它们更有效,且不会造成严重的副作用。虽然Nbs已经成功地应用于治疗危及生命的疾病患者,但在某些情况下,需要通过增加其效应物的特性来增强Nbs的效果,且仍被设计与其他治疗方法联合使用。

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